动物性食品中常山酮残留量的测定

1 范围

本标准规定了动物性食品中常山酮残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。

本标准适用于鸡的肌肉和肝脏组织中常山酮残留量的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的xin版本。凡是不注日期的引用文件，其xin版本适用于本标准。

GB/T 1.1-2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则

GB/T 6682分析实验室用水规则和试验方法

3 原理

试料中残留的常山酮，用胰蛋白酶酶解，乙酸乙酯提取，液液萃取，HLB柱净化，高效液相色谱-紫外测定，外标法定量。

4 试剂和材料

以下所用试剂，除特殊注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682规定的一级水。

4.1 氢溴suan常山酮对照品：含量≥99.6%。

4.2 甲醇：色谱纯。

4.3 乙酸乙酯：色谱纯。

4.4 乙腈：色谱纯。

4.5 无水碳酸钠

4.6 胰蛋白酶1000U/mg。

4.7 乙酸铵

4.8 乙酸

4.9 甲苯

4.10 HLB固相萃取柱：500mg/6mL,或相当者。

4.11 0.25mol/L乙酸铵缓冲液：取乙酸铵19.27g,加乙酸30mL,用水溶解并稀释至1000mL,用乙酸调PH至4.3。

4.12 0.125mol/L乙酸铵缓冲液：取0.25mol/L乙酸铵缓冲液500mL,用水溶解并稀释至1000mL。

4.13 10%碳酸钠溶液：取无水碳酸钠10g,用水溶解并稀释至100mL。

4.14 流动相：取乙腈250mL、0.25mol/L乙酸铵缓冲液150InL和水600mL,混匀，用冰乙酸调PH至4.3,滤膜过滤，现配现用。

4.15 200ug/mL常山酮标准贮备液：精密称取氢溴suan常山酮标准品10mg,于50ml棕色量瓶中，用0.25mol/L乙酸铵缓冲液溶解并稀释至刻度，配制成浓度为200ug/mL的常山酮标准贮备液。密封，用铝箔包裹，2～8℃避光保存，有效期6个月。

4.16 10ug/mL常山酮标准贮备液：精密量取200ug/mL常山酮标准贮备液0.5mL于10mL棕色量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10ug/mL常山酮标准贮备液。密封，用铝箔包裹，2～8℃避光保存，有效期为6个月。

5 仪器和设备

5.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器。

5.2 分析天平：感量0.00001g。

5.3 天平：感量0.01g。

5.4 离心机

5.5 均质机

5.6 涡旋振荡器

5.7 旋转蒸发仪

5.8 氮吹仪

5.9 固相萃取装置

5.10 恒温水浴箱

5.11 滤膜：0.45um。

6 试料的制备与保存

6.1 试料的制备

取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。

—取均质后的供试样品，作为供试试料。

—取均质后的空白样品，作为空白试料。

—取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。

6.2 样品的保存

-20℃以下保存。

7 测定步骤

7.1 基质匹配标准曲线的制备

精密量取10ug/mL的常山酮标准贮备液适量，用甲醇溶解并稀释,配制成浓度为50、100、300、500和1000ug/L的系列标准溶液，各取1.0mL,分别加至经提取、净化步骤处理的空白试料洗脱液中，于38℃水浴下氮气吹干，用流动相1.0mL溶解残余物，供高效液相色谱法测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

7.2 提取

称取试料(4±0.04)g,于100mL离心管中，加胰蛋白酶50mg,加水2mL(肝脏组织)或水10mL(肌肉组织)，涡动1min,用10%碳酸钠溶液调PH至8.0,于40℃水浴下酶解3h。取出，放至室温，加10%碳酸钠溶液2mL,涡动1min,再加乙酸乙酯20mL,涡动10s,在冰水浴中静置3min,立即2000r/min离心2min,将上清液转入100mL分液漏斗中。下层液用乙酸乙酯20mL重复提取一次，合并两次上清液于同一分液漏斗中，加0.125mol/L乙酸铵溶液10mL,振摇1min,静置2min,收集下层水相。再加0.125mol/L乙酸铵溶液10mL,重复萃取一次，合并两次水相，转至鸡心瓶中，于38℃旋转蒸发，除尽残余的乙酸乙酯，备用。

7.3 净化

HLB柱依次用甲醇3mL、水3mL和0.125mol/L乙酸铵3mL活化，取备用液过柱，控制流速1mL/min,用甲苯2mL洗涤，挤干，用甲醇3mL洗脱，收集洗脱液，于38℃氮气吹干，用流动相1.0mL溶解残余物，混匀，滤膜过滤，供高效液相色谱法测定。

7.4 测定

7.4.1 色谱条件

色谱柱：C₁₈(150mm×3.9mm,粒径4um),或相当者；

流动相：乙腈-0.25mol/L乙酸铵缓冲液-水；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

检测波长：243nm；

进样体积：25uL。

7.4.2 测定法

取试样溶液和相应的对照溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。对照溶液及试样溶液中常山酮响应值应在仪器检测的线性范围之内。

7.5 空白试验

除不加试料外，采用*相同的步骤进行平行操作。

8 结果计算和表述

试料中常山酮的残留量(ug/kg)：按下式计算

式中：

X—供试试料中常山酮的残留量，ug/kg;

C—试样溶液中常山酮浓度，ug/mL;

V—溶解残留物所用流动相体积，mL；

m—供试试料质量，g。

注：计算结果需扣除空白试料值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

9 检测方法灵敏度、准确度和精密度

9.1 灵敏度

本方法检测限为25ug/kg；定量限为50ug/kg。

9.2 准确度

本方法在50～500ug/kg添加浓度水平上回收率为80%～110%。

9.3 精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤20%。