抗体的制备（二）

一、半抗原的设计与人工抗原的制备

如前所述，小分子化合物不能使动物机体产生免疫反应。在免疫分析中，小分子化合物抗体的制备通常是将该化合物或化合物的特征部分与蛋白大分子结合，使之获得免疫原性，然后刺激机体产生抗体。抗体可以特异性地与目标化合物结合，发生免疫反应。这种仅具有和相应抗体结合的免疫反应性，而没有免疫原性的物质叫做半抗原。与半抗原结合，并使其获得免疫原性的蛋白质叫做载体。载体与半抗原的复合物叫做人工抗原或*抗原。半抗原通常通过一个双功能化合物(即分子两端都具有活性功能团的化合物)结合在载体蛋白上，这段化合物称为连接臂或间隔臂。半抗原的设计和合成是影响抗体的选择性和特异性的关键步骤，也是一个免疫亲和萃取方法能否成功建立的关键。一般而言，在半抗原和人工抗原的设计和制备过程中应综合考虑以下几个主要因素:

①半抗原的化学结构在大小、几何形状、化学组成、电荷分布等条件应尽量与目标化合物类似，尤其是要保留日标化合物的特征分子部分。很多情况下，以化合物的特征分子部分作为半抗原的主体，免疫动物制备的抗体对目标化合物都具有较好的特异性和选择性。

②避免用对免疫反应有重要作用的功能基团(如-NH₂，-NO₃等)与连接臂结合。因为与连接臂分子结合后，这些基团的化学特性将可能发生很大变化，从而可能对生物体的免疫响应产生“误导”，使机体产生的抗体不能很好地识别目标化合物。

③由于抗体的特异性和选择性与半抗原上的分子在免疫系统中的暴露状况有关，因此，连接臂与半抗原的结合位点应尽量远离半抗原分子的特征位点。

④尽量避免在连接臂上出现杂原子(如N、S、P等)和吸电子基团，因为这些基团可能影响半抗原的电子分布，使半抗原与目标分子的相似性降低，影响免疫效果。常用的间隔臂一般由一个或几个亚甲基基团组成。

⑤间隔臂的长度应适中。间隔臂的作用一方面是将小分子连接到载体蛋白上；另一方面是将小分子突出，使其免受载体蛋白屏蔽效应的影响。间隔臂的长度以3～6个分子距离为宜，太长的间隔臂会因空间折叠而减弱目标分子结构在免疫系统中的暴露。但是，对分子尺寸比较大的半抗原，间隔臂的重要性降低。

与放射性标记免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)、免疫传感器(Immunosensor)等免疫分析方法不同，免疫亲和萃取对抗体的特异性要求可以相对较低，因为目前使用免疫亲和萃取或免疫亲和色谱的主要目的是将样品基质中难以用常规方法去除的于扰物，如腐殖酸等去除，而且可以将免疫亲和柱的洗脱液送入色谱柱进一步分离，所以在实际应用中，具有“分类识别”(Class-se-lective)能力，即对某一类化合物具有亲和能力的抗体可能更具有实用价值。“分类识别”抗体的制备可以通过在半抗原分子上有意识地突出此类化合物的特征分子结构来实现。

由于抗原与抗体的结合是通过非共价相互作用实现的，因此，可以利用计算机分子模型，通过分析半抗原分子与目标抗原分子之间的相似性来指导半抗原的选择与合成。通常考察的参数为分子的空间构型、电子分布等。例如，对于目标化合物2,4,6-二氯苯酚(2,4,6-TCP) ,可以在如图8-3所示的四个位置(1～4)衍生化，制备半抗原，为进一步优化选择与目标化合物性质相近的半抗原，利用半经验MNDO和PM3数学模型对这些化合物的空间构型、总电荷、苯酚环各碳原子上的电荷分布等进行分析，发现在1号位置衍生所制备半抗原与目标化合物的上述性质为接近。进一步的ELISA实验证明，利用该半抗原制备的抗体对2,4,6-TCP具有很高的特异性。

图8-3 2,4,6-TCP半抗原的衍生化位置

二、多克隆抗体的制备

用抗原免疫动物后得到的动物血清(抗血清)，是由体内分别针对抗原物质上的多个抗原决定簇的多个B细胞克隆发生应答后产生的，因此叫多克隆抗体。早用于免疫研究的抗体就是多克隆抗体。对同一抗原决定簇，动物也可产生不同族、亚族和不同亲和性的抗体，即使同一抗原用同一剂量免疫，也可因动物的种类和采血时间的不同，使血清中抗体的组成各异。因此，常规免疫血清中的抗体是多种多样的。

通过常规免疫制备多克隆抗体的基本方法是：用剂量约为0.5mg·kg^-1体重的抗原和等体积的佛氏*佐剂充分混合，形成稳定的油包水胶体，再加入0.1～0.2mL灭活的划痕卡介苗，使浓度约为0.1～0.2 mg·mL^-1佐剂，混匀。免疫家兔，致敏。家兔一般选用年龄6个月左右，体重约3 kg的健康新西兰大白兔，2～3只。此后，每间隔7～10d加强免疫一次，加强免疫时用佛氏不*佐剂与抗原等体积混合。一般加强免疫3次即可，但第3次加强免疫之前，应取兔耳缘静脉血做抗体效价测定，以确定加强免疫的次数。当抗体的效价达到满意的结果时，将家免麻醉，进行颈动脉放血。一般每只家兔可收集兔血100～150mL。收集的血液室温放置1～2h，然后在4℃冰箱中过夜，使血清析出。用滴管吸取上层血清，下层血清和血浆混合物在1500r离心10min，将血清和血浆分离。血清中加入NaN₃(NaN₃的终浓度为0.2‰)，分装，-20℃保存。

在一些免疫分析(如ELISA、RIA)中，可直接用抗血清进行分析。但在免疫亲和萃取中，因为要对抗体进行固定化，所以需要从抗血清中分离纯化IgG。常用的纯化方法主要有硫酸铵沉淀法、离子交换柱色谱法、蛋白质A吸附法等，具体操作可参阅相关文献。

文章来源：《环境样品前处理技术》

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